Filtros de Microscópio de Fluorescência  e Sondas FISH – Como escolher?

Filtros de Microscópio de Fluorescência e Sondas FISH – Como escolher?

Para a técnica de hibridização in situ fluorescente (FISH) é obviamente necessário um microscópio de fluorescência. Em geral, sua configuração é composta de uma fonte de luz intensa de amplo espectro. Esta luz é filtrada por um filtro de excitação que transmite luz em uma determinada faixa de comprimento de onda e posteriormente é desviado por um espelho dicróico (dispersor de feixe). A luz desviada passa pela objetiva e é direcionada para a amostra que está hibridizada com uma sonda de interesse, conjugada a um fluorocromo (molécula fluorescente).

Os fluorocromos são então excitados e emitem luz em um comprimento de onda maior do que o da luz de excitação. Essa luz da fluorescência emitida pela amostra volta através da objetiva e passa pelo espelho dicróico devido ao comprimento de onda ser mais longo. A luz é então filtrada pelo filtro de emissão que define o comprimento de onda da luz que atingirá a ocular, definindo a cor que será observado ao final.

Os fluorocromos emitem luz de comprimentos de onda específicos quando excitados pela luz do respectivo comprimento de onda da fonte de luz de excitação. Esta luz de excitação é produzida por certas fontes de luz como a lâmpada de mercúrio de 120 watts que tem uma vida útil de aproximadamente 2000 horas e deve ser trocada regularmente. Caso contrário, a intensidade do sinal poderá diminuir.

Outro fator importante de se ater é quanto ao óleo de imersão, que deve ser compatível com microscopia de fluorescência para evitar autofluorescência podendo comprometer a leitura e interpretação. As lâminas e lamínulas de vidro também devem ser adequadas para microscopia de fluorescência.

De especial relevância é a escolha do conjunto de filtros do microscópio. Em geral, recomendamos o uso de cubos com um conjunto de filtros de passagem que são compostos por filtros de excitação e emissão compatíveis mais um espelho dicróico.

Os conjuntos de filtros escolhidos devem ser compatíveis com as faixas de comprimento de onda de excitação e de emissão do fluorocromo conjugado das sondas. As sondas FISH da Zytovision utilizam os seguintes fluorocromos:  

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